Star Activity

Las endonucleasas de restricción, los Jedi de la genética molecular, cuerpo de élite preciso y quirúrgico, sabios en la localización de su diana e implacables en la ejecución de su tarea, cortar allí y solo allí. Elegidos por  la vida y entrenados por la evolución, infalibles en su cometido hasta que surge el miedo que conduce a la ira y la ira a la degradación del ADN.

Ilustración de Dr. Litos (confeccionada utilizando esta imagen para el fondo)

Si queréis saber más acerca de la intensidad de la Fuerza en estos Jedi moleculares podéis echar un vistacillo aquí o aquí. Resumidamente se puede decir que estos enzimas reconocen y cortan secuencias de ADN muy específicas. El ADN es una cadena compuesta por una secuencia que mezcla las 4 nucleótidos químicamente diferentes: Adenina (A), Timidina (T), Guanina (G) y Citosina (C). Ellos son capaces de buscar su secuencia diana (compuesta por unos pocos nucleótidos en un orden concreto) dentro una doble cadena de ADN, que a cualquier mortal se nos haría infinitamente larga, y además, cortarla de manera precisa y ordenada, siempre de la misma manera (Figura 1).

Figura 1: Secuencias diana de tres enzimas de restricción comúnmente usados: Hind III, Sal I y EcoR I, respectivamente (JoF#6).

La Fuerza es intensa en ellos, son conocidos por ser buenos y justos, pero ninguno está libre de pasarse al Lado Oscuro. Cuando la hostilidad de su entorno supera un límite, a veces, algunos llegan a perder el juicio y la masacre se cierne sobre el ADN. Algunos lo llaman “Star Activity”, otros Actividad Estrella, pero todos saben que es el Armagedón del Plásmido (Figura 2). A pesar de esta sinrazón, muerte y destrucción, hace mucho, mucho tiempo en un laboratorio muy muy lejano, la ciencia encontró una explicación.

Figura 2: Plásmido digerido con enzima ScaI. El plásmido, en condiciones normales (carriles 10 a 13) genera 5 bandas tras digestión completa con ScaI. Si la concentración de ScaI es más elevada (carriles 2 a 9) se inicia la “Star activity”, aparecen bandas que no deberían. Si la concentración es muy baja (carriles 14 a 21) la restricción es incompleta y el enzima no corta todos los sitios que debería con lo que faltan fragmentos, o hay menos cantidad de los mismos. En el carril 1: 1-kb marcador pesos moleculares de ADN; carril 2 contiene 600 U de enzima ScaI; carril 10 contiene 2,4 U; carril 12 contiene 0,6 U; carril 21 contiene 0.002U ScaI. La reacción es efectuada a 37°C durante 1 h. Las flechas verticales corresponden a los dos puntos críticos:

HNS--> la cantidad de ScaI más alta que no muestra "Star Activity". 

LCC--> la cantidad de  ScaI mínima necesaria para la restricción del plásmido sea completa. 

Los enzimas de restricción son proteínas procedentes de microorganismos, se extraen y purifican para poder trabajar con ellas en el laboratorio. Para que puedan funcionar fuera de su medio natural es necesario que el líquido en el que se encuentran tenga un pH concreto y una composición determinada de sales y otros componentes, además de una temperatura adecuada (como bien explica en JoF#6, Raúl de la Puente @doctorGENoma). Estas condiciones se denominan condiciones estándar, y el líquido que las contiene, tampón estándar. Normalmente cada Jedi molecular se vende con un tampón concreto donde su actividad es óptima (el mismo tampón es óptimo, menudo, para varios enzimas). De hecho las casas comerciales que los suministran presentan tablas entretenidísimas donde marcan la actividad que tiene cada enzima de restricción dependiendo del tampón que se utilice(*). El lado oscuro de la fuerza se apodera del enzima cuando el medio en el que se encuentra, mezclado con un tampón y el ADN que ha de cortar, presenta condiciones NO  estándar. La “Star Activity” suele aparecer cuando la mezcla para hacer el corte en el ADN (digestión se llama) presenta baja concentración de sales, alto pH, elevada proporción de disolventes orgánicos (como alcoholes) y un exceso de enzima respecto a la cantidad de ADN. Vamos, que es fácil de imaginar, una cuadrilla Jedis con la tensión baja y borrachos tratando de acabar con un Sith dentro de una habitación pequeña, la pueden liar “mu parda”.


Si alguna vez han estado ustedes borrachos o les ha dado una bajada de tensión, se pueden imaginar cómo el alcohol, o la falta de sal puede coartar la pericia y precisión del más excelso espadachín. A nivel molecular la cosa es más difícil de imaginar, pero entendible si se sabe cómo funciona la química de los enzimas de restricción.

Los enzimas de restricción son proteínas. Su función está ligada a su estructura molecular y a las interacciones que establecen partes de su estructura entre sí y con los sustratos a los que modifican (en este caso el ADN). Estas estructuras no son completamente rígidas, son dinámicas pero dentro de un rango y suelen requerir de la presencia de ciertos metales como magnesio o manganeso que aportan cargas eléctricas necesarias para la catálisis, el mantenimiento de la estructura, y/o la interacción con el sustrato. Veamos un ejemplo, y qué mejor ejemplo que el mentor de esta, nuestra santa casa, HindIII. Este enzima actúa mediante dimerización, es decir dos moléculas de HindIII se unen para reconocer y cortar su secuencia diana  (Figura 3).





Figura 3: La estructura del complejo HindIII-ADN (dos moléculas de HindIII una en rojo y otra en gris). (a) Vista superior del complejo. (b) Vista del complejo a lo largo del eje de la caden de ADN. Las esferas pequeñas son metales con Mg2 + (azule) y Mn2 + (verdes).



Sólo unos pocos aminoácidos de las secuencia de HindIII interacionan con el ADN. En la Figura 4 se pueden ver un mapa tridimensional y un mapa plano de estas interacciones. No debe olvidarse que todas estas interacciones son interacciones químicas al servicio de la materia viva (normalmente de tipo electrostático, es decir carga positiva con carga negativa)**. En condiciones normales, la secuencia de ADN que mejor se adapta a la interacción con los aminoácidos del sitio activo de HindIII es esta, dadas las características químicas y de carga de los nucleótidos que contiene. El enzima realiza un reconocimiento aleatorio de la inacabable cadena de ADN, y cuando una secuencia cuadra con su sitio activo (incluidos los metales), el enzima se ancla a ella y procede con el corte. En la “Star Activity” estas intercciones no son estables debido a que el centro activo se desestructura un poco. Con baja concentración salina los metales se escapan del centro activo, con pH elevado o presencia de alcoholes la estructura es más dinámica o menos estable de lo que debería (se suelen dar redistribuciones de carga eléctrica)**. Entonces la secuencia de ADN que mejor cuadra con el centro activo, ahora ebrio, es diferente y menos estricta que en condiciones normales, como resultado, el enzima de restricción corta, no una secuencia, sino varias similares o totalmente diferentes dependiendo de lo afectado que esté su centro activo.

Figura 4: Interacciones HindIII-ADN. (a) visión esteroscópica de la interacción entre un solo monómero de HindIII y ADN (Os reto a que veais la imagen en 3D sin quedaos bizcos). Se muestra sólo un monómero de HindIII. (b) Vista del reconocimiento de pares de bases de HindIII. El ADN se muestra en amarillo y magenta. (c) Mapa plano de los contactos entre aminoácidos de HindIII y las bases de ADN.

Este es el secreto del lado oscuro de los enzimas de restricción. El lado oscuro es el mal, el desastre en el tubo de ensayo, la maldición de la digestión del plásmido. Pero no olvidéis padawanes que en el principio de los tiempos de la biología molecular sólo existían unos pocos Jedi. Fue entonces cuando los Maestros de la Fuerza usaron el lado oscuro para conseguir cosas que de otro modo hubiesen sido imposibles. Por ejemplo, consiguieron cortar secuencias  5´…NAATTN…3´ (Donde N es cualquier nucleótido) después de hacer que el Jedi EcoRI conociese el lado oscuro.

Sí, ya sé, falta algo, no he hablado del secreto del sable láser, verdad. Paciencia, Anakin, paciencia… todo a su debido tiempo.

Notas:

* El conocimiento de los mecanismos moleculares y la estructura de estos enzimas ha permitido modificar sus secuencias para hacerlos mucho más efectivos y estables. algunas casas comerciales venden desde hace tiempo un variado elenco de enzimas de restricción que funcionan todos en el mismo medio: efectúan digestiones completas en 5 o 10 minutos, cuando las versiones naturales necesitan horas. Si has leído el asterisco antes de acabar el post, vuelve a leerlo después de acabarlo, igual se entiende mejor.

** Simplificación


Participación en carnavales:

Esta entrada participa en la XX edición del Carnaval de Química organizado por @bioamara en el blog La Ciencia de Amara.

Esta entrada participa en la XIX Edición del Carnaval de Biología, organizado por @MyrRB en su blog La Fila De Atrás

Bibliografía y fuente de las imágenes:

-The Fidelity Index provides a systematic quantitation of star activity of DNA restriction endonucleases
Hua Wei, Caitlin Therrien, Aine Blanchard, Shengxi Guan, Zhenyu Zhu
Nucleic Acids Res. 2008 May; 36(9): e50. Published online 2008 May. doi: 10.1093/nar/gkn182
PMCID:
PMC2396408

-Biologycal Christalography on line:
http://journals.iucr.o  rg/d/issues/2009/12/00/mh5029/mh5029.pdf