El error que llevó a una pista, que a través de un puente, condujo a un hallazgo

Esta entrada pertenece a una serie iniciada aquí, donde se narran aventuras y desventuras en torno al estudio de las enfermedades raras. Pienso que pueden resultar especialmente interesantes tanto para todo aquel que quiera saber cómo funciona el día a día de la investigación biomédica, como para jóvenes investigadores que comienzan sus andadas en el mundillo, a los que espero servir de "abuelo cebolleta" para derribar algunos mitos y tal vez, quién sabe, alimentar otros. Todas las entradas de la serie pueden leerse aquí.

En la última entrega explicamos cómo la mutación de la serina 25 afectaba a laforina, y mencionamos  que dicha mutación le impedía formar dímeros. Antes de entrar en materia en la siguiente parte de este relato científico, conviene hacer  una introducción al respecto.

La historia de hoy nos llevará hasta un puente. Esta es toda la relación entre el bellísimo fotograma de Manhattan de Woody Allen y el post que tenéis entre manos, pero toda excusa es buena para meter algo de cinefilia en el blog.

Qué narices es un dímero

Las proteínas pueden realizar sus funciones bien asociándose a otras proteínas, o de manera individual; pero también pueden hacerlo formando estructuras aún más complejas que ellas mismas, asociándose entre sí. Por ejemplo, en la imagen de abajo podéis ver cómo una misma repetición de dos unidades (una en verde fosforito y otra en azulito moñas) de Jindetrés, perdón, HinDIII, correctamente asociadas, forman una estructura con forma de canal donde encaja perfectamente la molécula de ADN (naranjita) que sufrirá el corte característico de la actividad catalítica de la proteína. Cada unidad de una misma proteína (una única molécula) se llama monómero, y según el número de monómeros que formen una estructura hablamos de dímeros (dos moléculas de la misma proteína asociadas), trímeros (tres), y así sucesivamente. En general, se habla de oligómeros o multímeros, para no tener que dar un número; y a todas estas posibilidades se les llama estado de oligomerización. Esto es lo que se conoce como estructura cuaternaria de las proteínas, y les permite realizar tareas diferentes de las que podrían realizar en forma exclusivamente monomérica.

¿Cómo se comprueba esto? Básicamente, se puede estimar el estado de oligomerización de una proteína haciéndola desplazarse a través de una sustancia tipo gel. Al aplicar una corriente eléctrica a dicho gel, la proteína se desplaza a través de la sustancia gelificada, y lo hace en función de su tamaño molecular, es decir, las proteínas más grandes quedan más arriba y las más pequeñas, más abajo; algo parecido a lo que explicamos aquí, solo que los geles para separar proteínas suelen estar formados principalmente por una sustancia llamada acrilamida. Así se puede identificar proteínas distintas. Normalmente, lo que se hace al colocar las proteínas en el gel, es tratarlas previamente para desnaturalizarlas. Esta palabra bastante horrible implica desplegar las proteínas, convirtiéndolas en un amasijo lineal de aminoácidos en lugar de la construcción de Lego llena de pliegues y engranajes que comentábamos en el capítulo anterior. Así se consigue que la separación en el gel se haga en función del tamaño de la cadena de proteína desplegada, para que la forma de la proteína no influya en el movimiento de ésta a través del gel. Para desnaturalizarlas, normalmente se aplica lo siguiente: se hierven unos minutos, y se añade un agente reductor fuerte que sirve para evitar que se formen puentes disulfuro, una típica forma de unión entre proteínas (ojito a esto, que es importante para después). PERO: si lo que queremos es distinguir si una misma proteína está presente en forma de unidades, o en parejas, o por tríos (ya sabéis, ménage à trois oligomerización…) lo que haremos será NO hervirla ni aplicar agente reductor. Así veremos de qué manera se desplaza a través del gel: si obtenemos una mancha (sí, tristemente el gel se traduce en una serie de manchas a distinta altura) del tamaño molecular equivalente a 1 molécula de proteína, es que siempre va sola; pero si la mancha está más alta, y equivale exactamente a 2 veces el tamaño esperado, significará que está representada por dos moléculas de proteína unidas, y así sucesivamente. En el caso de laforina, a pesar de que no existe una estructura tridimensional que lo demuestre, se había demostrado por otros métodos que en determinadas condiciones era capaz de unirse a sí misma para formar dímeros. Un trabajo del año 2006 [1] iba más allá, y llegaba a afirmar que para que laforina realizase la catálisis en la reacción fosfatasa, debía estar en forma dimérica. Nuestras pruebas, por tanto, se basaban en comparar muestras hervidas y con un agente reductor añadido (ditiotreitol, DTT para los amigos, en nuestro caso) con las mismas muestras pero sin hervir y sin DTT. En las primeras, habrá sólo monómeros; en las otras, tantas formas como unidades de laforina se unan entre sí.

Así es como solemos ver los dímeros: a la izquierda, la escala de tamaño muestra que laforina "normal" (WT, wild type o tipo silvestre) aparece como dos manchas mayoritarias (que podrían equivaler a cuarentaypico y ochentaypico, justo el doble) mientras que al añadir DTT y hervir, sólo aparece la banda más pequeña;  y al estudiar las formas mutantes S25D y S25A, observamos que sólo se obtiene mayoritariamente una banda de las pequeñas. 

Ya habíamos comprobado mediante esta serie de pruebas, que laforina estaba presente siempre en forma de moléculas únicas (monómeros) y dímeros (dos laforinas unidas). Hasta aquí, todo cuadraba con lo publicado en los artículos del tema (recordad, especialmente, [1]). Y así es como pudimos constatar que las laforinas mutadas en el aminoácido serina 25, eran menos proclives a formar dímeros. Hasta este momento, el que laforina formase o no dímeros no nos importaba demasiado; era meramente una característica más a analizar (muchas veces no se sabe la función de las propiedades bioquímicas de una proteína, pero a base de saber cómo cambian en determinadas circunstancias, se acaba sabiendo o aprendiendo datos relevantes para otras cuestiones). Aunque personalmente me extrañaba que era realmente difícil observar los dímeros, y mayormente siempre se encontraban los monómeros como forma mayoritaria en casi todas las condiciones. Y hete aquí que un día sucedió algo, algo que nunca antes me había pasado y muy pocas veces me ha vuelto a pasar: que una observación casual, producida además por una cagada un despiste, desencadenase una serie de hipótesis y experimentos que terminaron constituyendo una línea de trabajo independiente y novedosa. Algo que yo pensaba sólo sucedía en las películas, o en las biografías de intrépidos científicos de carreras prestigiosas. Pues no, al parecer a los científicos cutrones también les pasa.

El despiste y la pista

Fue algo tan simple como que, haciendo una de tantas pruebas en busca de dímeros, me olvidé de hervir las muestras. Justo estaban ya colocadas en el gel y realizando su feliz marcha hacia el polo positivo, cuando caí en la cuenta: “uy, ¡pero si no las he hervido!” (los científicos llevamos siempre muchas cosas al mismo tiempo, así que probablemente me hubiese distraído mientras tuiteaba alguna cosa superingeniosa). En fin - me dije - eso ya no tiene remedio. Ya puestos, continué con la prueba (con lo que cuestan de hacer estas cosas, en tiempo y dinero, rara vez se tira un experimento a medias) y lo que me encontré fue que, mientras que en los tubos sin hervir ni añadir DTT me encontraba los clásicos monómeros y dímeros, en los otros, que SÍ tenían DTT pero NO estaban hervidos (por mi mencionada ineptitud), ¡sólo había monómeros! La conclusión era obvia: sólo con añadir DTT, sin necesidad de desnaturalizar las muestras, se perdía la capacidad de laforina de formar dímeros. Además, esta misma conclusión sugería una hipótesis muy obvia: la presencia de dímeros de laforina, depende de un entorno oxidante (de ahí que se pierdan al añadir agentes reductores). Y según lo que conocemos de la bioquímica de las proteínas, esto es un claro indicador de que la forma en que se asocian esos monómeros es mediante puentes disulfuro. Así que nos topamos, de golpe y porrazo, con una hipótesis de partida cuya comprobación nos podría dar la clave de la naturaleza de las uniones entre monómeros de laforina.

Como se puede apreciar en este resumen, tanto hervir como añadir DTT bastan, de manera independiente, para eliminar todo rastro de dímeros. 

Las cosas a partir de aquí fueron, sorprendentemente, bastante rodadas: el resultado se reprodujo todas las demás veces que lo repetimos, en diferentes condiciones. Contactamos con nuestros amiguetes yankis (ya sabéis, los pollos de Kentucky) y efectivamente, ellos habían observado lo mismo, de hecho ya llevaban un trabajo bastante avanzado en torno a las características de dimerización (o no) de laforina. Repetimos la estrategia de combinar datos, y para resumiros la historia finalmente pudimos demostrar que laforina es una proteína mayoritariamente monomérica, pero que es capaz de formar dímeros en las condiciones de oxidación pertinentes, condiciones que de potenciarse producen además una agregación de las moléculas de laforina. Pero lo mejor de todos estos datos, era que arrojaban  luz sobre un hecho que aparecía revelador: si todo esto era cierto, también era virtualmente imposible que las formas diméricas de laforina fuesen las responsables de su actividad catalítica, como sugería el trabajo publicado en 2006. Esta cuestión la vi cristalinamente clara, como una revelación mística: si algo había hecho yo hasta ese momento, era ensayos de actividad fosfatasa con proteínas del mismo tipo de laforina (ya os contaré toda esa aventura cuando os hable del tema de mi tesis): y para todas, todas ellas, la presencia de DTT o un agente reductor similar es IMPRESCINDIBLE para que se produzca la reacción. Nuestros datos demostraron que cantidades irrisorias de DTT ya eliminaban todo rastro de dímeros; era imposible, por tanto, que con las cantidades necesarias para producirse una adecuada reacción fosfatasa en los ensayos de actividad enzimática, hubiese ni por asomo alguna asociación entre monómeros de laforina.

Las mismas cantidades crecientes de DTT se usaron en paralelo para demostrar que sólo con 10 mM se eliminan casi todos los dímeros (izquierda), y que en las condiciones típicas de ensayo fosfatasa (100 mM) no hay ni rastro de ellos, mientras que dicha actividad aumenta proporcionalmente a partir de concentraciones de DTT entre 1 y 100 mM (derecha)

Hay que decir que, pese a las cantidad de formas distintas que usamos para confirmar esta hipótesis, y además entre ambos laboratorios, nos fue muy difícil que el artículo fuese aceptado en algunas revistas, las cuales se mostraban reacias a admitir unos resultados que iban en contra de publicaciones anteriores. Finalmente y tras reunir todavía más datos, el trabajo fue aceptado [2]. Pero personalmente, me carcomía la duda de si este asunto de los monómeros-dímeros no sería una mera cuestión metodológica, un efecto de las condiciones experimentales sobre muestras de proteína producida artificialmente. ¿No serían los dímeros un producto de la manipulación en el laboratorio? ¿Existían en las células, y de ser así, tenían alguna función para laforina? El siguiente paso a dar era obvio para nosotros: debíamos seguir la pista que sugería la participación de puentes disulfuro. Los puentes disulfuro son enlaces que se producen entre dos aminoácidos de cisteína. No voy a aburriros describiendo cómo se forman, pero brevemente mencionaremos que se trata de un enlace entre los átomos de azufre presentes en aminoácidos de cisteína. Ya hemos reiterado que dependen de un ambiente oxidante concreto. La idea sugerida por nuestro trabajo era que una molécula de laforina establecía un enlace entre una de sus cisteínas y la cisteína equivalente en otra molécula de laforina, formando una pareja enlazada y feliz para siempre. Para siempre, hasta que un ambiente reductor (como la adición de DTT) lo deshiciera. ¿Cómo comprobar esta posibilidad?

Puentes disulfuro (¡sulfuro!): a la izquierda, esquema de dos cisteínas unidas por sus átomos de azufre. A la derecha, un esquema de una inmunoglobulina, proteínas que forman los famosos anticuerpos con forma de "Y". Las cadenas ligeras o pesadas son cadenas de aminoácidos (cadenas polipeptídicas), es decir, monómeros, que se asocian entre las de su mismo tipo o las opuestas, y dicha asociación s econsigue mediante establecimiento de puentes disulfuro (S-S) entre cisteínas que forman parte de la cadena de cada uno de esos monómeros.

Diseño experimental minucioso y estrategias desesperadas

Primero hace falta comprobar si hay cisteínas en laforina. Efectivamente, en su secuencia hay nada más y nada menos que 9 cisteínas. La forma más fácil de averiguar si alguna o varias estaban implicadas en formar enlaces tipo disulfuro, es obvia y los que hayáis leído el post anterior la imaginaréis: eliminemos la cisteína candidata, cambiándola por un aminoácido que no contenga átomos de azufre (la "S" de los esquemas de arriba), y veamos si sigue habiendo dímeros. Tras una ardua investigación bioinformática, analizando la secuencia lineal de aminoácidos y comparándola con proteínas equivalentes a laforina en otros organismos evolutivamente relacionados, y tras modelar estructuralmente la posición de todas esas cisteínas, llegamos a decidir que había una entre las nueve que tenía todas las papeletas para ser la cisteína responsable. Así que la mutamos, analizamos en busca de la presencia de dímeros...

... y allí estaban. Como si nada. Lo cual demuestra una vez más que la teoría viene muy bien para enfocar los trabajos, pero la biología siempre nos sorprende. Así que pasamos al plan B, que es el que la mayoría de las veces se suele utilizar por ahorrar tiempo y no dejar cabos sueltos: mutemos TODAS las cisteínas. Y justo en ese momento, al amigo Pablunchu, que ya llevaba un tiempo paseándose por el laboratorio, se le ocurre sacarse una beca de colaboración y nos viene con la ingenua idea de pedir que le dirigiésemos un proyecto. Como ya conté aquí, fui el encargado de dirigir dicho proyecto, y me vino de perlas para enseñarle a mutar aminoácidos a diestro y siniestro. Bien, el chico mutó las cisteínas una por una, y una por una fueron demostrando ser totalmente irrelevantes para la formación de dímeros. Hasta llegar a la última. Efectivamente, fue únicamente la cisteína 329, antepenúltimo aminoácido de laforina, la que al ser mutada produjo una forma de proteína única y exclusivamente monomérica. 

Resumen del trabajo de Pablunchu: arriba, un esquema de laforina (formada por dos partes funcionalmente diferenciadas, una en rojo y otra en azul) donde se ve la distribución de cisteínas a lo largo de la secuencia lineal; más abajo, una representación tridimensional de la disposición en el espacio de toda la estructura, y dónde se colocarían esas cisteínas. Abajo del todo, un gel como los que veíamos más arriba, donde se aprecia con rotundidad y alevosía que sólo la forma mutante C329S aparece exclusivamente como monómero (diapositiva cortesía del mismísimo Pablunchu)

Acudimos a nuestros amigos de Kentucky y nos proporcionaron un dato igualmente interesante: ellos disponían de una forma de laforina cortada justo por ese aminoácido (una forma truncada, como se conoce en la jerga)... y que tampoco dimerizaba. Por nuestra parte, el disponer de una proteína exclusivamente monomérica nos abría las puertas para experimentar cualquier característica de laforina, sabiendo que el resultado, fuese cual fuese, no dependería en absoluto de formas de laforina asociadas entre sí. Así fue como confirmamos nuestros datos preliminares, pues el mutante era perfectamente activo como fosfatasa; y no sólo eso, sino que además era capaz de unirse a malina y formar un complejo activo y funcional, capaz de ubicuitinar a proteínas reguladoras del metabolismo del glucógeno. Es decir: a todas luces, laforina no necesita dimerizar para hacer todo aquello que sabemos que hace en condiciones normales.

¿A dónde lleva realmente este puente?

Siendo sinceros, las conclusiones de este último trabajo [3] no arrojan una luz especial sobre la enfermedad de Lafora; pero sí iluminan el camino correcto. Definitivamente, laforina puede realizar todas sus fucniones en forma monomérica. De hecho, podríamos aventurarnos a pensar que la asociación de laforina en formas oligoméricas no es sino una consecuencia deletérea, producida por condiciones de oxidación exacerbadas. Dadas las características de la enfermedad de Lafora y la gran relevancia que los agregados de proteínas tienen en su desarrollo, estas ideas no parecen en absoluto descabelladas, y actualmente conforman parte importante de nuestra línea de investigación. Si forma dímeros en condiciones fisiológicas, cosa que todos estos datos ponen bastante en entredicho, será para realizar alguna función que desconocemos o para modificar sutilmente las que ya nos son familiares. Todavía estamos intentando zanjar estas cuestiones, y espero que durante el desarrollo de la tesis doctoral de Pablunchu se respondan al menos parte de ellas. Es uno de los frentes que dejo abiertos con mi marcha del laboratorio, pero espero poder seguir trabajando en ello desde la distancia. En el último capítulo de esta retrospectiva (que será en un par de posts, si todo marcha según lo previsto), haremos alguna reflexión más al respecto, en el que espero sea una especie de resumen final. Pero todavía queda un último capítulo por narrar; y dado que este no es un relato estrictamente cronológico (queda muy bonito contarlo así, pero todos estos experimentos y deducciones se desarrollan fragmentadamente a lo largo de varios años, llevando en paralelo otros trabajos; fijaos en la fecha de publicación de los artículos que vamos refrenciando y veréis), he dejado para el final un trabajo ligeramente independiente de lo contado hasta ahora, uno de los que más orgulloso me siento, tal vez sea porque nace de una de mis pasiones en el campo de la biología: sí amigos, nada más y nada menos que... la evolución.

Y hasta ahí puedo leer. Bueno, puedo leer más, pero leyendo hasta ahí queda más emocionante.

Continuará...

Referencias

[1] Liu Y, Wang Y, Wu C, Liu Y, Zheng P. Dimerization of Laforin is required for its optimal phosphatase activity, regulation of GSK3beta phosphorylation, and Wnt signaling. J Biol Chem. 2006 Nov 17;281(46):34768-74. Epub 2006 Sep 12. PubMed PMID: 16971387.

[2] Dukhande VV, Rogers DM, Romá-Mateo C, Donderis J, Marina A, Taylor AO, Sanz P, Gentry MS. Laforin, a dual specificity phosphatase involved in Lafora disease, is present mainly as monomeric form with full phosphatase activity. PLoS One. 2011;6(8):e24040. doi: 10.1371/journal.pone.0024040. Epub 2011 Aug 26. PubMed PMID: 21887368

[3] Sánchez-Martín P, Raththagala M, Bridges TM, Husodo S, Gentry MS, Sanz P, Romá-Mateo C. Dimerization of the glucan phosphatase laforin requires the participation of cysteine 329. PLoS One. 2013 Jul 26;8(7):e69523. doi: 10.1371/journal.pone.0069523. Print 2013. PubMed PMID: 23922729