Laforinas mutantes y el pollo de Kentucky

Esta entrada pertenece a una serie iniciada aquí, donde se narran aventuras y desventuras en torno al estudio de las enfermedades raras. Pienso que pueden resultar especialmente interesantes tanto para todo aquel que quiera saber cómo funciona el día a día de la investigación biomédica, como para jóvenes investigadores que comienzan sus andadas en el mundillo, a los que espero servir de "abuelo cebolleta" para derribar algunos mitos y tal vez, quién sabe, alimentar otros. Todas las entradas de la serie pueden leerse aquí.

En el último post nos quedamos con la duda de si la proteína AMPK era la responsable de fosforilar a laforina, y en caso afirmativo, de qué narices supondría esta fosforilación para la vida de laforina y su efecto sobre las células (recordemos que conocer los detalles de la biología de esta proteína es crucial para llegar a entender el origen de la enfermedad de Lafora, y tal vez, cómo conseguir curarla algún día). Como también  adelanté, ya existía entonces una pista muy importante respecto a cuál era el aminoácido candidato a ser fosforilado, pista que yo debía terminar de seguir hasta dar con una respuesta. 

Si comparamos las piezas de Lego con los aminoácidos que se engarzan para formar las proteínas...

... un Iron Man de Lego equivaldría a una proteína con unas propiedades MUY molonas (para comprender qué rayos tiene esto que ver con el post, sigan leyendo por favor)

Estudiar las piezas para entender el conjunto

Recordemos que las proteínas están fabricadas en base a una secuencia lineal de piezas encadenadas, llamadas aminoácidos. La forma en que esta cadena se pliegan es crítica para la función de la proteína, y una vez adquirida, sólo algunos aminoácidos quedan expuestos en la superficie. Son estos aminoácidos más externos los que más fácilmente están expuestos a procesos como las fosforilaciones, adiciones de un grupo fosfato que se une de manera bastante fuerte, y cuya eliminación requerirá de un proceso opuesto, la desfosforilación, llevada a cabo por proteínas de naturaleza distinta. La adición de este grupo fosfato puede causar estragos en la estructura global de la proteína, y además puede tener resultados totalmente contradictorios: puede hacer que se adquiera una forma más activa, o inactiva; eliminar la posibilidad de unión a otras proteínas, o facilitarla... para entender cómo es posible esto, pensad en las proteínas como una especie de construcción de Lego, a la que puedes añadir una pieza que impida la adición de nuevas piezas, o por el contrario haga de enlace/bisagra para que tu construcción adquiera capacidad de rotación y se acople más fácilmente a otra construcción independiente (en el ejemplo ilustrado de más arriba, imaginad que una pieza "extra" colocada en la parte del cuello de la armadura, impidiese la unión del casco. Ya me diréis qué hace Iron Man sin casco...). Lo malo de no disponer de datos acerca de la estructura tridimensional de laforina (como comentamos aquí), es que trabajamos a ciegas a la hora de averiguar este tipo de efectos que tienen las fosforilaciones. Para no aburriros con las técnicas, os diré que conseguimos acotar, de entre los 331 aminoácidos que componen la estructura de laforina, cuál era el que recibía el grupo fosfato proveniente de la actividad de AMPK. No fue tarea fácil, pues laforina es una proteína muy inestable y trabajar con ella mediante reacciones químicas en tubos de ensayo (los llamados ensayos in vitro) es tremendamente complicado; no digamos ya, si además mutamos alguno de sus aminoácidos, produciendo formas de laforina que normalmente no existen en las células. Sí, estos mutantes son más aburridos que los X-Men y las Tortugas Ninja, no se emocione nadie. En biología molecular, una secuencia mutada es aquella en la que se ha alterado la composición normal de los elementos que la forman: en el caso que nos ocupa, llamamos "forma mutante de laforina" a una en la que el aminoácido de serina en la posición 25 se sustituye artificialmente por un aminoácido de alanina, eliminando así toda posibilidad de fosforilación, ya que ambos aminoácidos tiene propiedades químicas muy diferentes.

Encuentra las diferencias: en un lado, una secuencia genética en la que la sucesión de nucleótidos "TGT" se ha sustituido (mutado) por "GCT", con el resultado de que la proteína que se forma como producto de dicho gen cambie un aminoácido de cisteína por uno de serina. Y al otro lado... bueno, imaginad la cantidad de genes que habrían tenido que cambiar para que unas anodinas tortugas se conviertan en guerreros ninja devoradores de pizza. 

Resumiendo: mediante esta estrategia de mutagénesis combinada con experimentos donde se utilizaba fosfato marcado radiactivamente (una forma muy sencilla, aunque suene peligrosa, de trazar la incorporación de compuestos de fósforo en las proteínas), y geles bidimensionales que permiten distinguir formas de una misma proteína pero con carga eléctrica ligeramente distinta (la adición de grupos fosfato aporta cargas eléctricas negativas, de ahí parte de su efecto modulador de las interacciones entre proteínas), comprobamos que, efectivamente, sólo se perdía la capacidad de recibir el grupo fosfato si alterábamos este aminoácido candidato. Parece que, por lo tanto, el trabajo estaba zanjado: laforina sufre una fosforilación en su aminoácido de serina 25, fosforilación que realiza la proteína AMPK. Fin. Pues no. Todavía quedaban muchos cabos sueltos y muchas comprobaciones por hacer: los experimentos que habíamos realizado eran, como hemos comentado, in vitro, forzando las condiciones en tubos de experimentación, pero no teníamos datos experimentales que demostrasen que esta fosforilación tenía lugar dentro de células en cultivo (un entorno mucho más parecido al fisiológico). Pero entonces sucedió algo muy frecuente en la historia de la ciencia... algo que a veces trae consecuencias no muy deseables, pero que en otros casos como el que nos ocupa, supone un gran refuerzo para el trabajo. Se trata de... la competencia.

Laforinas al otro lado del mundo

No es ningún tópico: los científicos trabajamos muchas veces contrarreloj, temerosos de que otro grupo investigando el mismo tema nos "chafe" los resultados. Cuanto más "de moda" o "popular" sea el tema, más posibilidades de que suceda esto. En nuestro caso, pensad que hay muy pocos grupos en el mundo estudiando la minoritaria enfermedad de Lafora, con lo que lógicamente todos andamos, a grandes rasgos, detrás de las mismas preguntas y las mismas respuestas. Pero hay dos formas de enfocar este dilema, y personalmente creo que los acontecimientos demuestran que la forma en que lo afrontamos nosotros resulta de lo más beneficiosa para todos. Cuando mi jefe coincidió en un congreso con el jefe de otro grupo "rival", y decidió en vez de callarse nuestros resultados (preliminares pero esperanzadores) contárselos detalladamente, obtuvo por respuesta una reacción inesperada.

Dado que el grupo con el que tan estrechos lazos hemos creado, está ubicado en el estado de Kentucky, USA, los llamamos cariñosamente Kentucky Fried Chickens. Típica garrulada española, vamos.

El otro jefe, después de ponerse primero verde y luego del resto de colores del espectro visible, le confesó que ellos habían llegado exactamente a los mismos resultados: tenían la certeza de que la serina 25 se fosforilaba, y que AMPK era la responsable de ello. Sorprendentemente, sus datos se complementaban con los nuestros en gran medida: tenían certeza del aminoácido, pues habían llegado por una técnica distinta y sin necesidad de mutantes; y habían comprobado que la fosforilación se producía también dentro de las células, de manera dependiente de la presencia de AMPK. Pero les faltaba gran parte del contexto, pues no habían visto, como nosotros, que  la interacción entre laforina y malina aumentaba en presencia de AMPK, ni sabían cómo afectaba a laforina esta fosforilación (cosa que os contaré en el último párrafo). Después del susto, por tanto, ambos resolvieron lo más inteligente: formar un frente común, compartir resultados y realizar una publicación conjunta [1]. Y ahora, un mini-inciso para reflexionar sobre esto.

-Comienzo del inciso-

Tampoco es un tópico: hay muchísimos investigadores que recelan muy mucho de contar sus resultados y de compartir autorías. Bien es cierto que realizar un descubrimiento entre poquita gente (publicaciones con apenas un par de autores) tiene mucho más mérito. Pero estamos trabajando en esto para descubrir cosas, no para competir en una especie de concurso. Y si para que unos resultados adquieran robustez se requiere confirmación mediante otro tipo de aproximaciones que nuestro grupo no es capaz de realizar, y el conjunto final es una visión más amplia de determinado problema, bienvenidas sean las manos extra. Tristemente, la comunidad científica (y especialmente, los que la evalúan) parece empeñada en primar la individualidad premiando la trayectoria "excelente", representada únicamente por las publicaciones gordas (es decir, en revistas de gran índice de impacto) y las autorías mínimas; pero esto es un flaco favor para el avance general de la ciencia, y provoca que un gran número de investigadores, tal vez menos ambiciosos pero igualmente competentes (o sencillamente, trabajando en campos poco "mediáticos"), se queden en el camino. Personalmente, os digo con total sinceridad, una de mis mayores satisfacciones a nivel profesional fue comprobar que esos resultados con los que yo trabajaba, de cuya validez dudaba día tras día (recordemos cosas como esta, que nos pasan a los científicos a menudo), habían sido reproducidos, mediante técnicas distintas y por muy distintas manos, al otro lado del Atlántico. Esto me dio una inyección de confianza brutal y me animó mucho, pues por extraño que parezca y por muy científico que sea nuestro trabajo, al fin y al cabo somos humanos (aunque muchos no lo parezcamos) y a veces arrastramos sesgos y visiones subjetivas que pueden no reflejar realmente la realidad que estudiamos, y esto es un miedo que siempre está ahí, al acecho (recomiendo la lectura de este magnífico artículo de Banchsinger al respecto). Como último apunte en este inciso, decir que con esta anécdota se inició una colaboración continuada en la que se repitió una y otra vez lo mismo: ambos grupos andábamos abordando los mismos problemas desde perspectivas sutilmente diferentes, y como resultado, pudimos publicar varios trabajos colaborativos que iré referenciando a su debido tiempo, según vayan apareciendo en estas memorias.

- Fin del inciso -

Y por fin, ¡por fin!, llegamos al fin de esta historia. Aunque ya os habréis dado cuenta de que estas historias nunca tienen fin... pero por lo pronto, sí llegamos a cerrar un bloque de resultados. O temporalmente, al menos. Una vez nos creímos que la fosforilación de la serina 25 de laforina por AMPK era real, faltaba saber qué consecuencias tenía para la función de laforina y, por extensión qué significado podría tener respecto al esquema general de la enfermedad de Lafora. Lo que averiguamos al respecto se resume en que esta fosforilación afectaba tanto a la capacidad catalítica de laforina (su actividad enzimática como fosfatasa), como a su capacidad de formar dímeros (complejos que incluyen dos unidades de laforina fusionadas), pero no a su capacidad de unirse a malina (de hecho, la aumentaba), ni a su capacidad de unirse a carbohidratos. Porque una de las propiedades claves de laforina es que es capaz de unirse al glucógeno, el carbohidrato de reserva energética de los mamíferos, y producir una desfosforilación del mismo (por algo laforina pertenece a la familia de las fosfatasas, que eliminan grupos fosfato). Por tanto, nuestros datos parecían sugerir el siguiente modelo:

Según los requerimientos metabólicos, la proteína AMPK fosforila a laforina en su dominio de unión a carbohidratos (CBM, donde se halla la serina 25; la fosforilación aparece representada por nuestro viejo amigo Fosfatín), haciendo que ésta se una a malina de manera más eficiente. Como laforina sigue siendo capaz de unirse al glucógeno (representado por esa especie de bola peluda), mantien unida a malina y una vez allí llevan a cabo la función que pensamos tienen cuando están juntas: promover la degradación de las proteínas de síntesis de glucógeno, deteniéndola (malina provoca el etiquetado de dichas proteínas mediante ubicuitina, lo cual conduce a su eliminación). Este modelo cuadra con el hecho de que en la enfermedad de Lafora, bien sea porque falta laforina o malina, se acumula glucógeno en células donde no debería acumularse (neuronas, sin ir más lejos) (modificado de [1])

Pero, ¿cuáles eran las consecuencias directas de la fosforilación? ¿Era crucial para la función de laforina y malina, o sólo para determinadas situaciones en las que AMPK entraba en juego? ¿Tendría un rol específico en el desarrollo de la enfermedad una alteración en el mecanismo de fosforilación de laforina? Estas son las respuestas que se derivaron de aquel trabajo... y que todavía siguen sin responder. Pero como ya he comentado con anterioridad, los caminos de la investigación suelen surgir donde uno menos se lo espera, y de todas estas conclusiones hubo una, aparentemente insignificante, que dio lugar a una línea de trabajo inesperada y bastante interesante. Y tiene relación con esta frase que he escrito más arriba:

“…su capacidad de formar dímeros"

Efectivamente, según lo publicado hasta aquel momento, las moléculas de laforina eran capaces de unirse de dos en dos, formando una estructura dimérica que se estimaba era crítica para funciones tan importantes como la propia actividad catalítica [2]. Nuestro mutante era incapaz de dimerizar correctamente. Y en el transcurso de realizar los experimentos que demostraban esto, surgió algo que nos hizo dudar de algunas cosas que conocíamos de laforina, iniciándose una ardua pero muy satisfactoria tarea que básicamente consistió en luchar contracorriente por demostrar que algo publicado hacía años no era del todo cierto, con la necesaria y consecuente aportación de pruebas que respaldasen semejante osadía. Una historia bastante interesante que merece su propio post.

Continuará...

Referencias

[1] Romá-Mateo C, Solaz-Fuster Mdel C, Gimeno-Alcañiz JV, Dukhande VV, Donderis J,

Worby CA, Marina A, Criado O, Koller A, Rodriguez De Cordoba S, Gentry MS, Sanz

P. Laforin, a dual-specificity phosphatase involved in Lafora disease, is

phosphorylated at Ser25 by AMP-activated protein kinase. Biochem J. 2011 Oct

15;439(2):265-75. doi: 10.1042/BJ20110150. PubMed PMID: 21728993

[2] Liu Y, Wang Y, Wu C, Liu Y, Zheng P. Dimerization of Laforin is required for its optimal phosphatase activity, regulation of GSK3beta phosphorylation, and Wnt signaling. J Biol Chem. 2006 Nov 17;281(46):34768-74. Epub 2006 Sep 12. PubMed PMID: 16971387.