Desnudando (molecularmente) a laforina

Esta entrada pertenece a una serie iniciada aquí, donde se narran aventuras y desventuras en torno al estudio de las enfermedades raras. Pienso que pueden resultar especialmente interesantes tanto para todo aquel que quiera saber cómo funciona el día a día de la investigación biomédica, como para jóvenes investigadores que comienzan sus andadas en el mundillo, a los que espero servir de "abuelo cebolleta" para derribar algunos mitos y tal vez, quién sabe, alimentar otros. Todas las entradas de la serie pueden leerse aquí.

Seguimos con el relato autobiográfico de mis andanzas estudiando las bases moleculares de la enfermedad de Lafora. En el punto en que dejamos la historia, se me estaba ofreciendo la posibilidad de experimentar con la proteína llamada laforina, intentando arrojar algo de luz sobre sus particulares propiedades como fosfatasa. Tras aceptar sin dudarlo, el jefazo me embarcó de golpe y porrazo en dos líneas complementarias que ya estaban más o menos en marcha: por un lado, me encargaría de continuar un trabajo bastante avanzado en el laboratorio, que constituía la herencia de una investigadora recién doctorada que dejaba el grupo; por otro, trabajaría  en una línea de colaboración con un grupo de nuestro mismo instituto, expertos en cristalografía. A partir de aquí, y como suele pasar en investigación, el trabajo fue saliendo a trompicones y derivando en direcciones inesperadas (un factor que otorga diversión y frustración a partes iguales a este bendito trabajo). Comentaremos por separado ambas líneas, y en posts venideros, las implicaciones derivadas de éstas. Por lo pronto, con estos primeros experimentos abordamos nada menos que el sugerente reto de intentar conocer a laforina de la forma más íntima posible, despojándola de su entorno celular e intentando desnudar su estructura.

Las proteínas "nacen" como una secuencia lineal de aminoácidos encadenados, que va sufriendo varios plegamientos hasta adquirir la estructura final de la proteína (la cual puede estar formada por más de una cadena)

La búsqueda de la estructura cristalina

Podría ser el subtítulo de una peli de Indiana Jones o Harry Potter; pero no, esta frase tan rimbombante se refiere a una de las estrategias que pueden resultar más desesperantes en el mundo de la biología molecular. Resumiendo muy mucho: una grandísima ventaja a la hora de estudiar una proteína y sus funciones fisiológicas, es conocer su estructura tridimensional. Como las proteínas son tan chiquititas (apenas unos puñados de átomos), no hay manera directa de “verlas” y para saber qué forma tienen (aunque sean pequeñas, sus átomos puedan adquirir estructuras de lo más complejas) debemos usar algunos trucos. El más habitual es intentar conseguir una gran cantidad de proteína tremendamente pura (es decir, obtener una solución donde en el líquido sólo se encuentre esa proteína y nada más) y forzar que adopte una estructura cristalina, tras lo cual se somete a un bombardeo con rayos X y se analiza la forma en que dicha estructura cristalina ha difractado (es decir, ha desviado la radiación en distintas direcciones). Gracias a los ordenadores actuales es fácil obtener las coordenadas de los átomos en un espacio tridimensional a partir de dicha información, y modelar la estructura de la proteína en base a esto. Mola, ¿eh?

Las imágenes de tirabuzones de colorines que tan habituales son en este blog son el resultado final de modelizar la estructura tridimensional que adoptan los átomos que forman la proteína.

Pues bien, si suena fantástico y complicado sobre el papel monitor, imaginad cuando uno se pone manos a la obra. Una de las primeras cosas que se aprenden en investigación es que toda técnica estudiada con anterioridad se convierte, cuando te pones a llevarla a cabo, en un calvario de problemas, puestas a punto, y soluciones chapuceras. En este caso concreto, además, existe una factor adicional: hay proteínas que jamás van a ser capaces de cristalizar. Y aunque esto se puede estimar con antelación, en muchos casos no se sabe qué grado de dificultad va a implicar no sólo obtener una difracción adecuada para estimar la estructura, sino simplemente si la proteína va a poder ser purificada con la suficiente pureza o si una vez conseguido esto, va a llegar a cristalizar.

Para ahorraros intrigas y mordimientos de uñas innecesarios, os adelanto que laforina es una de estas últimas. Desde que empezamos a intentar desentrañar su estructura en 2009, no hemos conseguido más que mejorar en gran medida la capacidad de purificación y pureza de la proteína; incluso llegamos a obtener pequeños cristales en una ocasión, pero no llegaron a “cuajar”, por decirlo de alguna manera. Puede parecer una batalla perdida (y en cierta medida lo es), pero durante todo el camino aprendimos una serie de cosas muy interesantes y, como veremos más adelante, todo esto junto con lo que os voy a contar a continuación sirvió para abrir una nueva línea de trabajo que sí nos ha dado algunas alegrías. Volveremos sobre este punto y sobre las consecuencias que hubiese tenido dilucidar la estructura de laforina, en el último post de la serie cuando hagamos balance final. Como adelanto - para crear de paso un poco de intriga - destacar que este objetivo es uno de los más ansiados dentro del campo de la investigación en la enfermedad de Lafora, por lo que el grupo que lo consiga tiene asegurado publicar los resultados en una revista probablemente de muy alto impacto. Lo cual implica sentar un precedente importante a la hora de avanzar en este problema. Bien, está ya bastante claro que nosotros no sentaremos ese precedente; de hecho, tengo bastante claro qué grupo será el que finalmente dé la campanada. Y además, no creo que falte mucho. Al menos eso espero, porque es una información de la que nos beneficiaremos todos.

Pero basta de divagar: ahora, sigamos desnudando a laforina, que es a lo que hemos venido.

Enséñame los fosfatos, muñeca

Vayamos ahora a la estrategia que mencioné primero, y que ocupó la mayor parte de mis esfuerzos nada más incorporarme (al trabajo, no de la silla). La compañera MC había sido la principal responsable de describir algunos detalles muy importantes acerca de la interacción entre laforina y otra proteína, conocida como malina (los fieles seguidores de Batablanca entenderán ahora de dónde salió la inspiración para ella), para formar un complejo funcional implicado en la degradación de proteínas. En aquel tiempo se perfilaba cada vez más la posibilidad de que los síntomas de la enfermedad de Lafora no se debiesen únicamente a los problemas de laforina para regular la correcta fosforilación del glucógeno (algo que había guiado la investigación en este campo durante años); al entrar en juego malina, el papel de laforina adquiría una relevancia extra, participando como proteína “guía” sin la cual malina no puede llevar a cabo su función de promover la eliminación de proteínas implicadas en la síntesis de glucógeno. El resultado de un fallo tanto en la estructura o función de laforina como de malina, conduce a lo mismo:  acumulación de glucógeno de manera aberrante, una de las señas de identidad más características de esta enfermedad. Bien, pues MC y colaboradores definieron una nueva interacción que ponía un nuevo personaje en juego: una proteína conocida como AMPK, con un papel fundamental en la regulación del metabolismo energético celular. Cuando disminuyen los niveles de energía disponibles en la célula, AMPK, cual ministro en tiempos de crisis, realiza automáticamente una serie de ajustes y reformas para solucionarlo. Entre estas medidas, está el potenciar la degradación del glucógeno para obtener glucosa que se convertirá en energía fresquita para la célula. Por tanto, la relación entre AMPK y el complejo laforina-malina podría encajar perfectamente en la regulación del metabolismo del glucógeno y tener un papel clave en el desarrollo de la enfermedad [1]. Más tarde, otros miembros y miembras del laboratorio comprobaron que otra proteína crítica en la transformación de glucosa en glucógeno, llamada R5/PTG, también estaba regulada por AMPK, reforzando la idea de que todos estos participantes formaban un conjunto de factores relevantes para cualquier patología que tenga que ver con una incorrecta formación de este compuesto [2].

Pero volvamos al trabajo inicial: la conclusión de este era que en condiciones de baja energía en la célula (y por tanto sometida a una elevada actividad de AMPK), laforina y malina interaccionaban mejor y eran capaces de degradar las proteínas de síntesis de glucógeno, provocando una disminución de este último. Todo esto fue comprobado de una manera laboriosa pero muy sencilla, utilizando células de levadura (sí, de las de hacer pan) cambiándoles el medio por uno con nutrientes menos energéticos, y comparando en cada condición el grado de interacción entre laforina y malina. Finalmente, este efecto no se observaba en células de levadura donde se había eliminado todo rastro de actividad de AMPK, confirmando de manera indirecta la parte de responsabilidad que esta pudiera tener sobre la capacidad de laforina y malina para juntarse y ser felices.

En este esquema se resume el modelo propuesto por MC et al. (ver Ref. [1] para más señas). Laforina y malina impiden la función (representado por la flecha sin punta) de PTG, lo cual implica que no se acumule glucógeno (si hacéis la cuenta de las flechas activadoras y las impedidoras, deduciréis el papel de cada proteína-bolita en todo el asunto). AMPK regula a varios de los componentes de esta ruta, y en conjunto, se explicaría la falta de laforina y malina como algo que conduce a una acumulación de glucógeno en  condiciones en las que no debería darse. ¿Es la flechita que une AMPK y laforina-malina una fosforilación? Al final del post os lo cuento.

Para cualquier biólogo molecular, esta conclusión plantea una posibilidad automática: puesto que AMPK es una proteína con actividad quinasa (es decir, capaz de fosforilar proteínas, agregando grupos fosfato que se quedan pegados a su estructura y alteran su función), ¿será el efecto observado el resultado de una fosforilación de AMPK sobre el complejo laforina-malina? Pues justo respondiendo a esta pregunta se había quedado MC cuando se marchó, y justo aquí comencé a indagar yo. Ciertamente sólo tuve que poner la puntilla a un exhaustivo trabajo anterior, que ya había delimitado las posibilidades hasta dejar un muy claro candidato a ser el aminoácido fosforilado por AMPK. Pero teníamos que comprobar que efectivamente, así era. Me puse manos a la obra, diseñé un par de mutantes que podrían confirmar nuestras sospechas, y encaminé todos mis esfuerzos a intentar discernir si ese candidato, y no otro, era el que sufría la fosforilación; y además, que era AMPK, y no otra quinasa, la responsable de esta fosforilación. La guinda del pastel sería descubrir en qué afecta la fosforilación a la estructura y función de laforina, y por consiguiente, la relevancia de este proceso en el desarrollo de la enfermedad.

Para saber si tuvimos éxito en responder estas cuestiones, tendréis que esperar al siguiente post.

Continuará...

Referencias

[1] Solaz-Fuster MC, Gimeno-Alcañiz JV, Ros S, Fernandez-Sanchez ME, Garcia-Fojeda
B, Criado Garcia O, Vilchez D, Dominguez J, Garcia-Rocha M, Sanchez-Piris M,
Aguado C, Knecht E, Serratosa J, Guinovart JJ, Sanz P, Rodriguez de Córdoba S.
Regulation of glycogen synthesis by the laforin-malin complex is modulated by theAMP-activated protein kinase pathway. Hum Mol Genet. 2008 Mar 1;17(5):667-78.

[2] Vernia S, Solaz-Fuster MC, Gimeno-Alcañiz JV, Rubio T, García-Haro L, ForetzM, de Córdoba SR, Sanz P. AMP-activated protein kinase phosphorylates R5/PTG, theglycogen targeting subunit of the R5/PTG-protein phosphatase 1 holoenzyme, andaccelerates its down-regulation by the laforin-malin complex. J Biol Chem. 2009
Mar 27;284(13):8247-55. doi: 10.1074/jbc.M808492200. Epub 2009 Jan 26. PubMed
PMID: 19171932; PubMed Central PMCID: PMC2659182.