Cuando la Tecnología punta mató a Michaelis-Menten

Empecemos por el final, demos por muerto algo que cae en desuso. Bueno este señor, que en realidad eran dos y no sólo señores, están muertos hace muchos años, pero aquí yo me refiero a su legado. Para los iniciados en las ciencias de la vida, las cinéticas enzimáticas Michaelis-Menten no son desconocidas, y más que recordar con clarividencia para y porqué se usaban, lo que recordamos es que eran una pesadilla, tanto de entender en el aula, como de efectuar en el laboratorio. Para los profanos, básicamente es una manera de estudiar las características de los enzimas, que no son otra cosa que proteínas capaces de facilitar una reacción química.

Este tipo de cinética fue desarrollada a principios del siglo XX por el Dr. Leonor Michaelis y la Dra. Maud Menten, y es, al menos para mi, el paradigma de los ensayos in vitro. No entraré en su complejidad y asunciones matemáticas. Su procedimiento experimental, así grosso modo, se resume: pones un enzima en un bote junto con todo lo necesario para que éste funcione y en un momento dado le adiciones el sustrato que dicho enzima ha de modificar (fosforilar, cortar, degradar, destruir, ubicuitinar etc etc..) y empiezas a contar el tiempo. Nótese, que previo a esto se tiene que: purificar un enzima estable y funcional, inventarse un método para medir la desaparición del sustrato o aparición de producto y estandarizar un sinfín de condiciones que pueden afectar al enzima (fuerza iónica, pH, temperatura, concentración de sustrato…). Esta aproximación (con sus modificaciones) se ha usado durante casi 100 años para medir las constantes cinéticas (las características) de todos los enzimas conocidos y purificables susceptibles de ser activos en un bote. Y ha sido de tremenda utilidad desde la ciencia del conocer por conocer hasta la farmacodinámica (que salva muchas vidas). Pero en la era del laser el “in vitro” está llegando a su fin (permítaseme pues usar la parte por el todo en el título).

En realidad los experimentos in vitro están aún lejos de desaparecer, pero con las nuevas tecnologías, la mayor parte de aquellos que nos dedicamos a estudiar los mecanismos de la vida, estamos cambiando el bote por la célula viva. Los avances de la ingeniería genética, junto con el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas biológicas como las proteínas y sustratos fluorescentes y los poderosísimos microscopios (que además de su refinadísima óptica, incorporan sistemas de control computarizado que permiten la manipulación a nivel de micrómetros) hacen posible que sea casi más fácil seguir el derrotero intracelular de tu "amada proteína X" que hacer una simple mezcla en un frasco. Se pierde el control total de todos los parámetros de la reacción (como no pasa in vitro) pero se gana, entre otras cosas, percepción de lo que pasa en la “vida real”, además, permite el análisis y cuantificación de procesos como el movimiento proteico intracelular, o las simples interacciones proteicas en ambientes nativos (es decir, naturales), que in vitro son casi imposibles de dilucidar.

Proteína verde fluorescente GFP (imagen arriba), absorbe luz Azul- violeta y emite luz verde. Fue obtenida en su primera versión de la medusa Aequoria victoria (abaj0). Sucesivas mejoras por ingeniería genética han generado tipos de GFP mas estables y brillantes, que son mas útiles.

Esta tecnología abre la veda del estudio proteico en célula simple, se pasa de sacar de un bote (in vitro) unos datos que son reflejo del comportamiento estadístico global de una población millones de moléculas, proteínas o miles de células, para estudiar decenas o cientos de moléculas en una decena o veintena de células, pero en profundidad. Ahí nos damos cuenta que todas se comportan parecido pero no igual, lo que da muchísima más información. Sírvame como ejemplo la maratón de New York. Estudiemos la velocidad en carrera de larga distancia del ser humano. En un in vitro clásico, teniendo en cuenta a todas las personas, en bloque vistos desde muy lejos, que corrieron la última maratón (45.334), sacaríamos la conclusión de que la velocidad del ser humano, en 40km, ronda los 10km/h. Pero usando esta nueva tecnología punta somos capaces de ajustar mucho más y podemos estudiar a los corredores uno a uno, a 20 de ellos por ejemplo, para ver que algunos corren a 19 km/h, los mas a 10 km/h y otros 7km/h. Pero dejemos los ejemplos inverosímiles y veamos algunos ejemplos reales:

Microscopía de fluorescencia: Que será la base. En breve, lo que se hace es unir una proteína concreta (X) a una de las proteínas fluorescentes existentes como GFP (que emite en verde) o CHERRY (que emite en rojo). X (-GFP, por ejemplo) se expresa en la célula, se pone la célula debajo del microscopio, y con suerte se verá en que parte de la célula está localizada nuestra proteína X (ahora verde o roja). E incluso, si la proteína se mueve, se puede seguir su desplazamiento con el tiempo (microscopía de fluorescencia en célula viva).

Esquema de cómo se le pone a una proteina X cualquiera una marca fluorescente, en este caso GFP (imagen)

Ejemplo real de microscopía de fluorescencia. Diferentes tipos celulares (de piel de rata, de carcinoma...), donde la misma proteína está marcada con GFP (imagen)

FLIP: Estas siglas abrevian la definición en inglés (que no usaré porque están en las imágenes). Esta técnica se llama algo así como “Pérdida de fluorescencia en fotoblanqueo”. Aquí lo que se hace es lo mismo que en la Microscopía de fluorescencia en célula viva pero además, usando un láser extraordinariamente preciso se "socarra" (fotoblanquea) de manera continuada la proteína fluorescente unida a nuestra proteina X en una pequeña parte de la estructura fluorescente que están tiñendo. Si con el avance del tiempo se pierde la señal fluorescente fuera del área de fotoblanqueo esto significa que nuestra proteína X de mueve alegremente de un lado a otro, y cuando se pone debajo del sol… digo del laser, pierde el brillo. En resumen, que se mueve por la estructura que marca, y que no es estática.

Esquema de FLIP Y FRAP, el rectángulo indica la zona de la célula que se fotoblanquea (en inglés, photobleach) en cada caso (Jennifer Lippincott-Schwartz and George H. Patterson, 2003, “Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells”. Science )

Ejemplo real de FLIP (ahora la imagen es en blanco y negro porque para publicarla tienes que pagar menos, y en este caso la información es la misma). El cuadrado indica la zona que se "socarra" (fotoblanqueo) continuamente. En la segunda foto se inicia el fotoblanqueo sóolo en la zona rectangular, podéis ver cómo la fluorescencia desaparece poco a poco del resto de la célula.(Jennifer Lippincott-Schwartz, Erik Snapp and Anne Kenworthy, 2001. Studying protein dynamics in living cells. Nature)

FRAP: “Recuperación de fluorescencia después fotoblanqueo”. Es lo parecido al FLIP pero al revés. Se "quema" la proteína fluorescente de una zona y se espera a ver cómo (sí o no) se recupera la fluorescencia.

Ejemplo real de FRAP. El cuadrado indica la zona que se "socarra" (fotoblanqueo), pero en este caso sólo durante un corto periodo de tiempo. Las tres fotos superiores corresponden a una proteína móvil, pues 5 min. después del "socarrado", el área en cuestión vuelve a ser fluorescente. Las tres imágenes inferiores son un control, haciendo el mismo procedimiento en una proteína que no es móvil, podemos ver cómo después del fotoblanqueo el área cuadrada permanece sin fluorescencia. (Jennifer Lippincott-Schwartz, Erik Snapp and Anne Kenworthy, 2001. Studying protein dynamics in living cells. Nature)

FRET: "Fluorescencia inducida por transferencia energética". Las implicaciones teóricas de esta técnica son más complejas físicamente hablando, pero la idea es simple. Una molécula es fluorescente porque recoge luz, sólo un tipo (por ejemplo azul, en el caso de la GFP) y luego la emite de otro tipo pero con menos energía (en este caso verde). Pues bien, qué pasa si usamos junto a GFP otra proteína que recoge luz verde y emite roja (ej. CHERRY), pues que si están lo suficientemente cerca la una de la otra, GFP le puede pasar la energía verde a CHERRY y esta emitirá en rojo. De manera que si queremos saber si dos proteínas (X e Y) interaccionan en su propio ambiente natural, unimos X a una GFP y a Y a CHERRY y las metemos en una célula. Igual que ocurre en la microscopía de fluorescencia, seremos capaces de ver la localización de cada una por separado si usamos la "luz activadora" concreta de cada cual. Pero si usamos la luz verde para activar a GFP y lo que vemos es roja (o amarilla = roja+verde) que sale de la muestra eso nos indica que nuestra proteína X y nuestra proteína Y están muy muy cerca (como Batablanca y Malina en algún momento)... interaccionando ( y no seamos mal pensados).

Ejemplo de FRET. Esta es otra aproximación de esta técnica se puede observar cómo cambia la forma de una proteína bajo ciertas condiciones (como acortando su longitud). A, control. B, un fragmento de proteína se dobla haciendo que las proteínas fluorescentes se acerquen. C, si el fragmento es más corto, existe más eficiencia en la transferencia de energía entre GFP y Cherry (David Llères, Samuel Swift, Angus I. Lamond, 2007. Detecting Protein‐Protein Interactions In Vivo with FRET using Multiphoton Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Current protocols )

Es cierto que después de leer esta parrafada acerca de estas técnicas super-tecnológicas, que son muy impresionantes, uno llega a la conclusión de que parecen no servir para nada aparte de para entretener a un montoncito de científicos fascinados por los colores brillantes. Sin embargo, su aplicación, junto con otro montón de técnicas (más o menos punteras y puntillosas), está permitiendo un conocimiento profundo de los mecanismos de la vida. Y esto es importante por muchas cosas, pero dos son principales desde mi punto de vista. La primera es que el simple conocimiento (aunque sea sólo por saber como es una bacteria o levadura) no es una pérdida de tiempo, aunque hoy no rinda beneficios económicos o no se sepa para qué sirve o servirá. Estas técnicas (y otras, que no son microscópicas) tiene sus bases en desarrollos científico-técnicos iniciados hace 20 o 30 años (cuando eran solo hacer por hacer), hoy son la punta de la lanza que pretende erradicar alzheimer, cáncer, sida, hepatitis, diabetes, malaria y un largo etc de plagas que asolan hoy nuestro mundo. Y la segunda, es que toda esta búsqueda-aplicación de conocimiento se hace, por lo menos desde la investigación con financiación pública (como mínimo en los 10 laboratorios que he pisado en mi vida), aplicando un nivel de precaución y protección ambiental y personal que si se tuviese en otros trabajos o quehaceres cotidianos, la mayoría no nos hubiésemos cortado con un cuchillo en nuestra vida.